一、 引言

1. 研究背景

昆虫肠道中栖息种类繁多、数量庞大的微生物，总称为肠道微生物群。其中，细菌是最主要的类群，统称为肠道菌群。肠道菌群既参与了宿主昆虫的生长发育、免疫机制与器官稳态维持、耐药性产生和行为活动等关键生理过程；又通过肠道免疫系统中精细的调控机制维持与宿主的共生关系[1]。果蝇是一种典型的有肠道菌群控制行为活动的生物。本课题聚焦果蝇肠道微生物的不同与其行为活动的关联，从而揭示人类不同肠道微生物与不同的肠道疾病和饮食习惯的关联。

2. 文献综述

目前已经发现野生果蝇具有更高的与果糖同化相关的微生物多样性，这表明微生物已经导致了特异性的代谢来处理与人工饮食相关的营养物质。肠道菌群能够通过跨膜受体PGRP-LC增强黑腹果蝇的系统免疫活性，而且醋酸杆菌是其中的核心菌种，肠道菌群代谢物乙酸，是其中的重要信号分子。然而，乙酸和跨膜受体PGRP-LC如何介导肠道菌群调控黑腹果蝇系统免疫活性的机理有待进一步研究[2]。

果蝇肠道菌群可以通过改变肠道内环境，调节宿主基因表达，影响干细胞命运。无菌条件培养的果蝇中肠道干细胞有丝分裂指数较低，表明菌群刺激干细胞增殖更新[3]。肠道菌群通过诱导压力和耐受机制改变肠道生理环境（通过改变pH和消化酶含量）来保证果蝇肠道上皮更新及干细胞活性[4]。另外，通过菌群与肠道干细胞之间的相互作用，影响果蝇老化及寿命[5]。由于果蝇的微生物结构没有人类复杂，微生物对宿主的影响是否具有特异性仍待研究，菌群的建立方式和免疫系统以及信号传递通路目前也都处于探索阶段。

3. 研究目的与意义

本课题将通过改变果蝇肠道微生物的控制变量法，实验观察含不同肠道微生物的果蝇在肠道感染、运动行为、繁殖发育等方面的不同生理表现，以此启示肠道微生物对生物影响的研究，并由此初步推断人类肠道菌群对肠道疾病的影响。

二、 方法与材料

1. 配置果蝇培养基5L

实验目的：为果蝇生长培养环境

1） 实验材料和作用

（1） 4.5L蒸馏水

（2） 53g琼脂：在液体培养基转变为固体培养基中发挥凝固剂的作用

（3） 160.5g酵母：散发吸引果蝇的气味

（4） 300ml蒸馏水

（5） 3.63g氯化钙：提供盐离子

（6） 158.1g蔗糖、288g葡萄糖：为果蝇生长提供能源物质

（7） 388.5g玉米粉：生长所需碳源

（8） 1200ml蒸馏水

（9） 10g山梨酸钾：起防腐作用

（10） 75ml尼可净（500ml 95%乙醇+100g对羟基苯甲酸乙酯）

2） 实验步骤：

（1） 依次加入上述材料并再加入过程中持续搅拌加热

（2） 将得到的稠厚黄色液体转移入培养管塞口冷存

3） 实验结果

培养基为浅黄色不透明固体，有深浅不一的少量颗粒，可能为玉米粉过粗无法溶解导致。

2. 准备无菌果蝇

1) 实验步骤

（1） 洗净并擦干滤网置于器皿中并准备一瓶蒸馏水

（2） 将装有纯净滤网的器皿和装有蒸馏水的容器放入高压杀菌器得到无菌滤网和无菌水

（3） 用锡纸包裹装有食物的培养管高温高压进行杀菌操作后储存在低温环境待用

（4） 将葡萄汁与琼脂混合配置培养基

（5） 用蒸馏水将酵母粉溶解至可成团状，并团成团状置于培养基中央

（6） 打开二氧化碳气瓶，向果蝇培养管中通入二氧化碳气体麻醉果蝇并将麻醉后的果蝇集中到同一个收卵器中

（7） 将培养基盖在收卵器上方，平放收卵器使果蝇着于器皿壁等待麻醉复苏

（8） 将收卵器置于黑暗环境下待产卵

（9） 待产卵后取出培养基得到附着在培养基表面的果蝇卵

（10） 在超净台进行取卵洗卵操作

（11） 使用五个无菌培养皿，依次盛装无菌水、与水1：1混合的无菌次氯酸钠溶液、75%乙醇、75%乙醇、无菌水，并用消毒的镊子取一个无菌滤网置于第一个培养皿（之后所有拿起滤网的操作都使用消毒镊子夹取）

（12） 用湿润无菌刷刮取培养基表面的果蝇卵置于滤网中进行过滤清洗，夹起滤网并用移液枪吸走滤网外的液滴后放入下一个培养基过滤

（13） 第二个培养基需要浸泡在次氯酸钠溶液中3分钟重复上述操作

（14） 第五个培养基洗涤之后用另一根无菌刷取漂浮在水面的卵转移入已灭菌的食物培养管

（15） 最后塞上棉花塞，得到无菌果蝇卵待孵化

2) 实验结果

得到763个无菌果蝇卵。

图1 收集完成等待产卵的果蝇

图2 收集到卵的培养基

3. 蓝精灵实验

1) 实验步骤

①　成虫

（1） 裁剪与培养管直径相同的圆形纸片并进行无菌操作

（2） 镜下操作分离雌雄果蝇（分离标准：雄果蝇尾部有大块黑色部分）

（3） 取两个空培养管分别做实验组对照组，分别放入30只雄果蝇进行饥饿操作

（4） 取两个食物培养管分别做实验组对照组，擦净管壁。

（5） 分别平放入滤纸片，实验组培养管用移液枪加入200微升与SDS混合的蓝色染料，对照组用移液枪加入无SDS的蓝色染料

（6） 再取第二片滤纸片重复步骤5

（7） 待充分浸润后用移液枪吸去多余液体后塞上棉花备用

（8） 二氧化碳麻醉实验组和对照组饥饿果蝇后转移至分别对应的蓝色染料培养管

（9） 一天后镜下观察

（10） 若蓝色染料经口器从肠道蔓延至全身则可得出肠道发生肠漏，若蓝色染料经口器只存在于肠道中则该果蝇未发生肠漏

②　幼虫

（1） 将食物底部幼虫连同食物挖出放入装有水的烧杯中洗涤

（2） 捞出后在纸上用毛刷挑出幼虫

（3） 分为实验组和对照组分别加入含有SDS和不含SDS的蓝色染料

（4） 镜下观察

（5） 原理与成虫相同

2) 实验结果

图3 对照组果蝇（仅肠道部分变蓝）

图4、5 实验组果蝇（全身变蓝）

图6、7 对照组（左，仅肠道部分变蓝）与实验组（右，全身变蓝）果蝇幼虫

3) 实验结论

SDS对果蝇有较强的致炎作用，会诱导果蝇发生肠炎，使其肠道发生肠漏。

4. LB培养基制备和微生物实验

1) LB培养基制备实验步骤

（1） 蒸馏水润洗锥形瓶

（2） 向锥形瓶中依次加入3g Tryptone粉末、1.5g Yeast extract粉末、3g NaCl粉末

（3） 加入300ml蒸馏水

（4） 若制备固体培养基则再加入6g琼脂粉

（5） 充分摇晃或搅拌后封口

2) 微生物实验步骤

（1） LB液体培养基接种ECC15。

（2） 稀释四倍，用分光光度计测OD值并四倍放大比例计算所需菌液体积=4.46ml菌液

（3） 平均质量分装菌液离心富集ECC15菌液

（4） 移液枪使用PBS溶液吹吸菌液

（5） 转移入小试剂管中再次离心并再次用PBS洗涤

（6） 第三次离心后用5%蔗糖溶液冲洗重复上述操作

（7） 第四次离心后用蔗糖溶液定容储存在4℃环境等待2小时

（8） 2小时后取对照组和实验组两个食物空管加入无菌滤纸分别加入200微升蔗糖溶液和菌液后再次加入第二张无菌滤纸重复加入上述溶液

（9） 挑选各30只雄果蝇分别加入对照组和实验组两个培养管培养一天

（10） 将LB固体培养基微波加热液化后无菌操作制作平板培养基

（11） 分别各取15只果蝇加入对照组和实验组两个装有陶瓷研磨珠的离心管

（12） 加入20微升无菌水，180微升培养液后离心，该溶液标记为A

（13） 稀释四倍后的溶液标记为D（实验组/对照组C）

（14） 稀释过程：采用梯度稀释法

（15） 平板涂布法将实验组和对照组的A、D液涂抹在平板表面

（16） 平板29℃储存

（17） 第二天观察平板并计数菌数

3) 实验结果

表1 两平板菌落数对比

图8 梯度稀释过程

图9 实验组（左）和对照组（右）所得菌的平板

4) 实验结论

实验组接菌果蝇所含ECC15菌数明显多于对照组，对照组果蝇内的菌可能含有果蝇自身体内所带有的菌。

5. 提取果蝇DNA

1) 实验步骤

（1） 在1.5ml离心管中加入无菌研磨珠并加入五只雄果蝇

（2） 使用移液枪加入250微升的去离子水

（3） 使用研磨器以60-65HZ的频率高速研磨一分钟

（4） 取出后加入250微升稀释两倍的A溶液

（5） 加入190微升的5M醋酸钾溶液震荡均匀，随后冰浴

（6） 冰浴15分钟后以13000g室温离心5分钟，取上清液转移至新离心管

（7） 再次以13000g室温离心5分钟后二次取上清液

（8） 加入750微升异丙醇溶液，混合均匀室温孵育5分钟

（9） 室温以13000g高速离心5分钟，取下层沉淀（即为基因组DNA）

（10） 加入1ml 70%乙醇溶液混匀

（11） 室温13000g高速离心5分钟再次取沉淀

（12） 风干至DNA呈透明状

（13） 加入100微升无菌去离子水并进行重悬DNA操作

（14） 使用超微量分光光度检测DNA浓度

图10、11对照组（左）和实验组（右）DNA浓度检测结果

（15） 将DNA稀释为100ng/μL

（16） 以200ngDNA为模板，即取对照组和实验组各2微升作为模板

（17） 配制PCR样液：使用两种特异性引物（rp49、WSP）和GF，分别设置实验组和对照组，分别加入6微升水、10微升2×mix溶液（含有酶和染料）、F（rp49：rp49-F、WSP：WSP-81F、GF：8FE）、R（rp49：rp49-R、WSP：WSP-691R、GF：1492R）、模板2微升

（18） 启动PCR程序：95℃ 15分钟；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1分钟，进行30个循环；72℃延伸10分钟

（19） 配制1%琼脂糖电泳凝胶：1g琼脂糖，100ml 1×TAE溶液，10微升核酸染料

（20） 加热配制溶液至无沉淀插上梳子并加入模具

（21） 成型后取出梳子和电泳胶放入电泳槽

（22） 由于DNA带负电，左负右正连接电源，把电泳胶放置在左侧，并将marker、实验组、对照组PCR后的样液滴入梳子形成的凹槽（加样孔）

（23） 120V电压50mA电流30分钟电泳

（24） 取出电泳后的电泳胶放入紫外凝胶成像仪成像分析

2) 实验结果

图12 rp49、WSP基因

从左到右为对照组rp49；对照组WSP；实验组rp49，实验组WSP

图13 16s基因，对照组（左）实验组（右）

根据marker对照分析，对照组与实验组均有rp49与16s基因，实验组含量高。而WSP基因仅存在于实验组果蝇体内。

3）实验结论

Rp49为果蝇的DNA片段，其存在证明此PCR体系有效。16s为细菌共有基因片段，在对照组中含量较少，实验组中含量较高，证明ECC15感染成功。

而WSP基因在对照组中被检出而实验组中没有，但实验过程中并未让果蝇感染Wolbachia菌，ECC15菌感染是否会对Wolbachia菌的生长造成影响待进一步实验探究。

三、 总结与展望

1. 总结

本课题主要研究了肠道共生菌与果蝇生理表现的关系，主要使用了控制变量法和对照法，先从有菌和无菌果蝇的培养开始记录实验过程，后续作为原料采用对照实验。本课题主要使用了蓝精灵实验和微生物实验分别揭示了果蝇肠道发生肠漏的现象及原理和建立了果蝇感染模型；得到了有未发生肠漏的果蝇对照镜下图片和单只果蝇所带菌的数据对比。最后提取了果蝇的DNA得到了电泳成像图。所有实验围绕肠道共生菌展开，说明了肠道共生菌于果蝇乃至与人类都是非常重要的部分。

由于果蝇与人类的相似性，本课题可以揭示人类肠道共生菌于人类来说也有极大作用，生理上，我们的肠道共生菌与我们的健康息息相关，它无时无刻不在变化，但始终达成平衡，一旦平衡被打破，便会诱发肠道疾病。

2. 展望

由于长期一起生活的人类的饮食偏好相似，南北方的人饮食喜好不尽相同甚至可能有排斥，且我们常常对某些气味和味道喜爱或想念，猜想肠道共生菌的变化与我们的饮食喜好有关系。希望在本课题的基础上，能够通过改变果蝇体内肠道共生菌建立模型进一步探究肠道共生菌与果蝇气味饮食喜好的关系，从而揭示人类肠道共生菌与饮食习惯和口味的关系。

参考文献

[1] 石章红，侯有明.昆虫与其肠道菌群互作机理的研究进展及其在害虫管理中的应用前景[J].环境昆虫学报，2020,42(04):798-805.

[2] 苏治平. 肠道菌群增强黑腹果蝇系统免疫活性的机理探究[D].福建农林大学,2022.DOI:10.27018/d.cnki.gfjnu.2022.000490.

[3] Broderick NA, Buchon N, Lemaitre B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. Mbio. 2014 May;5(3):e01117-14. DOI: 10.1128/mbio.01117-14. PMID: 24865556; PMCID: PMC4045073.

[4] Buchon, N., Broderick, N. & Lemaitre, B. Gut homeostasis in a microbial world: insights from Drosophila melanogaster. Nat Rev Microbiol 11, 615–626 (2013). https://doi.org/10.1038/nrmicro3074

[5] 金秋霞,王思宏,金丽华.果蝇肠道干细胞及肠道菌群的研究进展[J].生物技术通报,2021,37(04):245-250.DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0875.