普洱茶茶褐素所含主要高分子聚合物的物性表征研究
摘要
关键词
茶褐素，茶色素，普洱茶，物性表征
正文
* 基金项目:云南省科技厅科技计划项目（2018FD058）。
普洱茶是云南特色茶，历史可追溯到东汉时期。普洱茶具有一定的保健功能。茶色素类物质被视为普洱茶的一类重要特征成分。茶色素是茶叶中儿茶素及其衍生物氧化而成的，分子结构保持儿茶素的母核特征。茶色素也是复合体，一般学术界认为茶色素由茶黄素、茶红素、茶褐素组成[1]。其中茶褐素最为稳定，分子量也最大。目前在医学领域，通过大量临床病例证实，茶褐素具有抗脂质过氧化、增强免疫力功能、降血脂、双向调节血压血脂、抗动脉粥样硬化、降低血粘度、改善微循环、抑制实验性肿瘤等良好的药理作用[2]。
1 引言
对茶叶品质评价以及在对茶叶定级的标准上，茶色素尤其是茶褐素的理化指标都是很关键的评价指标。在普洱茶评价体系中，一般以多酚类物质含量和茶红素含量之和与茶褐素含量的比值来衡量普洱茶滋味品质的醇厚度[3]。该比值越高，茶汤越醇厚，刺激性越强；比值越低，则茶汤滋味越弱，渥堆后普洱茶中（TF+TR）/TB 的比值约为 0.03。当 TB 含量为 7.85%时，汤色呈红褐明亮的最佳汤色品质，是普洱茶中十分独特的品质成分[4]。
但是，目前在研究茶色素尤其是对普洱茶茶褐素的研究方面，大多研究集中于对其药用价值，以及理化指标的单方向研究，对于茶褐色各个理化指标之间的联系、基本理化性质之间的理论分析、表征性质的内在联系等方面的研究较少，而这些方面的研究，对于从整体上评价普洱茶的品质，更准确、有效的掌握样品茶叶的综合特性，就具有了一定意义上的市场研究价值。
2 实验与分析
2.1 提取路径
（1）路径：分类茶样品→乙醇浸取提纯→茶汤压缩→沉淀20h[5]→过滤后干燥→冻干保存。
（2）茶褐素提取：100g茶样品（发酵成熟的普洱茶）→粉碎（50目）→乙醇浸取提纯（4h）→抽干过滤→蒸馏水提纯（20h）→子酸乙酯萃取[6]→离心→沉淀→茶褐素（粗品）。
提取粗品茶褐素后，利用硅胶粉、聚酰胺、树脂[7]进行柱层析进行纯化，对分级纯化物进行显色反应，测定多糖含量。采用考马斯亮蓝比色法[8]测定蛋白质含量，见图1和图2。
图1 蛋白质标准曲线 图2 多糖标准曲线
2.2 多糖与蛋白质含量分析
发酵过程能够影响茶褐素的含量，样品中茶褐素的含量会随着翻堆过程的增加而增加。利用黑曲霉和酵母菌对普洱茶进行发酵，计算翻堆次数与茶褐素中多糖含量与蛋白质含量的关系[9]。结果表明，随着发酵时间的延长，茶褐素中多糖含量与蛋白质含量总体呈上升趋势，黑曲霉和酵母发酵之前有区别。酵母菌发酵样品中多糖的含量呈上升趋势，黑曲霉发酵在第二次翻堆多糖有所增加，第三次翻堆大幅度增加，而在第四次翻堆时减少。两种霉菌在翻堆过程中蛋白质含量均增加，可能与氨基酸和多酚类物质结合作用有关。详细含量图可见下表。
表1 黑曲霉和酵母菌随翻堆次数变化所含多糖和蛋白质的含量
样品 | 多糖含量（%） | 蛋白质含量（%） | |
黑曲霉发酵 | 原样品 | 19.80±0.01 | 15.2±0.02 |
二翻堆 | 23.01±0.02 | 14.51±0.02 | |
四翻堆 | 26.51±0.02 | 24.31±0.03 | |
六翻堆 | 32.64±0.03 | 32.87±0.03 | |
酵母菌发酵 | 原样品 | 25.31±0.01 | 19.54±0.02 |
三翻堆 | 32.61±0.01 | 20.13±0.02 | |
四翻堆 | 34.52±0.03 | 24.72±0.02 | |
2.3 发酵过程中茶黄素和茶红素含量分析
水溶性的茶褐素主要由茶黄素和茶红素构成。在发酵过程中，茶黄素和茶褐素的含量会随着发酵过程变化。通过对比黑曲霉菌和酵母菌的发酵过程，可以找到三种茶色素之间的联系，茶色素含量可见表2。可以看出，随着样品茶褐素含量的增多，茶红素和茶黄素的含量减少，增加量小于茶褐素的减少量，表明发生了氧化聚合、缩合过程。表明茶褐素有可能是多酚类、蛋白质、多糖类的复合结构。多酚类物质性质较为活泼，可能随着发酵过程的持续，形成了活性较高的醌类物质，该物质与蛋白质、多糖结合形成高分子聚合物。表明发酵过程是多类物质相互转换与化学反应的过程，从而也体现了制备工艺对茶褐素含量和品质的影响。
表 2 黑曲霉与酵母菌发酵过程中三种茶色素的含量
发酵方法 | 翻堆次数 | 茶样品/g | 茶样品增重/% | 茶褐素平均含量/g | 茶褐素含量/% |
酵母菌发酵 | 原料 | 60.31 | 0 | 1.52 | 2.52±0.03 |
第1翻 | 73.65 | 19.79 | 3.24 | 4.52±0.04 | |
第2翻 | 85.98 | 38.59 | 6.49 | 7.82±0.06 | |
第3翻 | 84.67 | 36.41 | 11.73 | 14.36±0.02 | |
第4翻 | 85.09 | 40.42 | 8.65 | 10.29±0.01 | |
黑曲霉菌发酵 | 原料 | 60.31 | 0 | 1.52 | 2.52±0.03 |
第1翻 | 71.65 | 18.79 | 4.26 | 5.95±0.05 | |
第2翻 | 82.98 | 37.59 | 5.98 | 7.21±0.04 | |
第3翻 | 81.67 | 35.41 | 7.47 | 9.14±0.03 | |
第4翻 | 84.09 | 39.42 | 13.80 | 16.41±0.02 |
从表2中还可以看出，在酵母菌发酵条件下，第三次翻堆茶褐素的含量达到最高值，第四次翻堆后含量反而下降。对比两种霉菌可以看出，利用黑曲霉发酵会提高茶褐素含量，发酵能够加速茶褐素的含量，说明发酵工艺与茶叶品质好坏具有一定的关系。
2.4 茶褐素化学组分分析
茶褐素通过分离提纯，可分析其水解产物的高分子化学组分，并进行表征。主要方法为HPLC分析法。通过对层析后的样品进行高效液相分析，利用甲醇水混合物进行洗脱，然后再进行紫外光谱检测。通过实验结果可以得到茶褐素水解化合物含亚甲基和次甲基两种分子结构，H原子和C原子谱的结果见表3。
表3 H和C谱分析结果
编号 | H1 | C13 |
1 | 3.58-3.71(2H,m) | 62.5(CH2) |
2 | 3.81(1H,m) | 73.4(CH) |
3 | 3.58-3.71(2H,m) | 62.5(CH2) |
通过分析可以得到，该化合物可能含有两个次甲基和一个亚甲基，结构对称。根据质谱分析，可知该化合物主要由碳、氢、钠、氧、磷五种元素构成，物性表征为多酚类物质。
3 结果与讨论
3.1通过不同发酵材料得到的普洱茶进行提纯，可以得到茶褐素原料，对不同微生物发酵过程中多糖与蛋白质的含量分析，可以得到黑曲霉与酵母菌对多糖和蛋白质发酵的影响。
3.2利用HPLC分析方法可以对茶褐素的水解产物中所含物质进行分析，得到化合物中所含有的元素构成，结果对进一步分析茶褐素的分子结构具有一定的基础价值。
3.3 茶褐素结构具有复杂性。茶褐素中多酚类物质在发酵过程中会发生氧化、聚合过程，形成的茶褐素含有多糖和蛋白质，给分离纯化增加了难度，且结构复杂多变，与实验、发酵等多项条件有关。在实验过程中，利用化学降解的方法，可以基本保持结构片段的完整性。
参考文献
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[7]胡圆圆,杨云忠,王萍,李绍仙,李艳,车涛.普洱茶及茶粉中茶褐素含量测定的研究[J].食品安全导刊,2021(30):46-48.[8]孟宪钰.普洱熟茶加成儿茶素及茶褐素化学研究[D].昆明理工大学2019.000258.
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